BIO-RAD CFX96仪器操作手册

CFX96实时定量PCR仪可用于定量PCR实验或是进行复杂的基因表达分析广泛用于基因表达分析、病原体检测、SNP分型等领域的定量与定性研究，可同时检测多个目标基因。 更快速：快速热循环仪缩减了运行时间，在30分钟内可以得到完美的实验结果。出厂即校正的光学系统，使你无需校正，即刻开始实验。更简便：可同时检测多个目标基因，节约试剂和样品，一次实验得到更多的数据，方便进行数据处理支持SYBR Green或FAM 快速扫描模式。温度范围0–100℃温度准确性 ± 0.2℃（达到90℃时）温度均一性±0.4℃（10秒内达到90℃时）温度梯度范围 30–100℃, 不低于室温30℃温度梯度温差范围1–24℃。

使用步骤

配置qPCR体系

1. 准备试剂：

qPCR Mix（预混液）：包含Taq酶、dNTPs、荧光染料（如SYBR Green）。

引物：根据你的目标基因设计特异性引物（上游引物和下游引物）。

cDNA模板：上一步逆转录得到的cDNA。

无菌水：用于调整体积。

2. 配置反应体系（通常在一个96孔板中进行）：

每个反应孔中加入：

10μL qPCR Mix

1μL 上游引物（10μM）

1μL 下游引物（10μM）

2μL cDNA模板

6μL 无菌水

注意：每个基因需要设置3个重复孔，以确保结果的可靠性。

对照组：设置一个无模板对照（NTC，用无菌水代替cDNA模板），用于检测引物二聚体等非特异性产物。

运行qPCR程序

目的：通过PCR扩增目标基因，并实时检测荧光信号的变化。

操作步骤：

1.将反应板放入qPCR仪中：确保孔位正确，盖好盖子。

2.设置程序：

预变性：95℃，3分钟（激活Taq酶）

循环反应：40个循环，每个循环包括：

95℃，15秒（变性）

60℃，30秒（退火和延伸）

熔解曲线分析：反应结束后，从60℃到95℃逐步升温，观察荧光信号的变化，用于确认扩增产物的特异性。

3.运行程序：按下开始键，仪器会自动运行并记录荧光信号。

分析结果

目的：通过qPCR仪生成的数据，分析目标基因的表达水平。

操作步骤：

1.查看扩增曲线：qPCR仪会生成每个孔的扩增曲线。理想的曲线应该是指数增长的。

2.确定CT值：CT值（阈值循环）是指荧光信号达到某个阈值时的循环数。CT值越小，说明基因表达量越高。

3.计算相对表达量：

公式：使用2^-ΔΔCT公式计算目标基因的相对表达量。

步骤：

ΔCT = CT（目标基因） - CT（内参基因）

ΔΔCT = ΔCT（实验组） - ΔCT（对照组）

相对表达量 = 2^-ΔΔCT

4.分析差异：比较不同样本之间的相对表达量，判断基因表达是否发生显著变化。

注意事项

避免RNA降解：RNA非常容易被降解，操作时要使用RNase-free的试剂和耗材。

引物设计：引物要特异性好，避免非特异性扩增。

重复实验：每个样本至少做3个重复，确保结果的可靠性。

内参基因：选择合适的内参基因（如GAPDH、β-actin），用于校正样本之间的差异。

Bio-Rad定量PCR仪日常维护注意事项

1、设备闲置时请勿将热盖打开，以免灰尘在样品槽模块上长期积累，影响热传递。

2、仪器运行完成后应及时处理样品槽模块上的反应管，避免将反应完成后的反应管长期置于样品槽上。

3、仪器热盖开闭为全自动控制，在通电状态，严禁人为干涉热盖的开启或关闭的行为，此类行为会导致热盖故障，危及仪器正常使用。

4、按照要求使用匹配的PCR管，不要同时使用不同规格的耗材。

5、请勿在样品盖敞开或泄露时运行反应，试剂可能会溢出并覆盖反应模块、内盖和传送器系统中的光学头，从而导致信号模糊。

6、在将反应管置于反应模块中之前应始终清洁其表面。若反应模块中滴入水或其他溶液，运行时潮湿的组件会引发电击。

7、定期清洁反应模块和内盖，以防积累污垢、危险生物材料或荧光溶液。任何污垢都可能会影响反应模块快速调节温度和收集准确荧光数据的能力。

8、定期清洁外盖和C1000基座。

9、请勿清洁或触摸内盖中加热器孔板后面的光学系统。

10、清洁时使用浸湿的无毛软布（软布尽量拧干，不可滴水），勿使用对铝具有腐蚀性的清洁溶液、强碱性清洁溶液（高浓度肥皂水、氨水或高浓度漂白剂）、腐蚀性或磨擦性清洁溶液，这些清洁试剂不但会损伤反应模块，还会影响热量控制的精度。

11、避免刮伤C1000反应模块基座表面，如果刮伤或损坏此表面，则会影响热量控制的精度。

12、在清洁设备之前，始终先从热循环仪基座拆除反应模块或拔出基座，避免遭受电击。

13、避免意外断电，建议为设备配置在线式UPS系统。

14、仪器运行结束前不得关闭系统电源，不得带电扳动基座背后的锁定杆。

15、仪器运行时不要搬动设备，若需要移动设备，需将设备设置为运输状态，正确安装运输螺丝，正确打包（此项操作需联系BIO-RAD工程师）。

16、定量PCR系统电脑专人管理，制定仪器的合理管理制度，严防电脑病毒感染，保证电脑系统的正常运行。